Abstract
皮肤作为哺乳动物最大器官, 是抵御外界刺激的第1道防护屏障。汗腺是皮肤重要附属器之一, 在维持电解质平衡和调节体温方面起着重要作用。大面积深度烧伤患者通常损伤会达真皮深层甚至皮肤全层, 损伤汗腺修复困难, 甚至无法再生, 患者排汗和体温调节功能受到严重影响, 生活质量降低。如何实现汗腺的功能化成为损伤皮肤再生医学的重要研究内容之一。本文对干细胞、组织工程等汗腺再生修复的转化应用技术进行阐述, 拟为汗腺再生研究提供理论参考。
Keywords: 汗腺, 转化型研究, 间充质干细胞, 组织工程
Abstract
As the largest organ in mammals, skin is the first protective barrier against external stimuli. Sweat glands are one of the important cutaneous appendages and play an important role in maintaining electrolyte balance and regulating body temperature. Patients with extensive deep burns usually suffer from damage to deep dermis or the entire skin layer. The damaged sweat glands are difficult to repair and even unable to regenerate, which seriously affects patients' sweating and thermo-regulation function, reduces patients' quality of lives. How to achieve the functionalization of sweat glands has become one of the important researches in regenerative medicine of damaged skin. This review summarizes the translational and application technology of sweat gland regeneration and repair using stem cells and tissue engineering, in order to provide a theoretical basis for the research of sweat gland regeneration.
Keywords: Sweat glands, Translational research, Mesenchymal stem cells, Tissue engineering
皮肤是哺乳动物最大的器官, 是抵御外界刺激的第1道防护屏障。汗腺是皮肤重要附属器之一, 在维持体内电解质平衡和调节体温方面起着重要作用[1-3]。大面积深度烧伤的患者受损皮肤为增生性瘢痕修复, 其修复后汗腺仍受损、再生潜能低, 因此皮肤丧失了排汗功能, 患者生活质量受到影响。因此, 皮肤损伤修复过程中汗腺再生已成为皮肤修复与再生医学研究的重要方向之一[4-6]。本文将从干细胞再生为汗腺细胞的能力及组织工程诱导汗腺再生的进展等方面进行总结梳理。
1. 汗腺自我再生能力
汗腺和毛囊是皮肤重要附属器, 在胚胎发育期同属外胚层。皮肤中毛囊干细胞具有各种组织生理学活性以及损伤修复潜能；同样, 汗腺组织也具有自体干细胞活性, 可以有效促进损伤汗腺组织通过自我增殖、转分化为汗腺细胞, 从而促进汗腺组织再生。既往研究显示, 从成人汗腺组织中分离出间充质干细胞（MSC）样细胞可能有助于创面修复和汗腺组织再生[7]。体内实验证实, 小鼠的汗腺细胞参与导管上皮细胞、表皮再生过程, 对创面愈合有促进作用, 说明汗腺中存在不同的多能和单能干细胞[8]。有研究表明, 汗腺细胞是新来源的独特干细胞, 其具有多向分化潜能、高增殖能力和显著自我更新的能力, 是人类皮肤创面再生的主要因素[9]。有学者对健康志愿者的创面再生情况进行评估, 观察到：（1）汗腺和毛囊皮脂腺通过促进KC生长最终形成新表皮, 从而促进人体创面愈合；（2）起源于汗腺的和起源于毛囊皮脂腺的KC生长速度与形式相近；（3）外分泌汗腺的数量比毛囊皮脂腺多3倍。上述研究结果表明, 汗腺中多能性和单能性细胞参与损伤汗腺附属器的自我修复与再生、皮肤创面重建, 最终促进创面愈合[10]。与毛囊皮脂腺细胞相比, 汗腺细胞数量较多, 二者分化成KC的速度相同, 进一步说明汗腺组织可以通过多种途径实现一定程度的自我再生。
2. 诱导多能干细胞（iPSC）诱导汗腺再生
2006年, Takahashi和Yamanaka [11]研究显示, 分化成熟的小鼠成体Fb可以被重新编程和去分化为胚胎样状态。成熟的小鼠Fb通过4种转录因子的反转录转化为iPSC。与胚胎干细胞相比, iPSC可避免强烈的免疫反应和伦理问题。iPSC已成为生物医学研究的关键资源, 并有望用于临床细胞移植、疾病模型建立和药物筛选。有学者将人的汗腺细胞体外培养, 培养皿中分别加入4种载有胚胎干细胞转录因子基因（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）的慢病毒, 可诱导出汗腺来源的iPSC, 待iPSC贴壁后添加汗腺细胞诱导培养基, 成功诱导出汗腺样细胞[12]。
3. MSC诱导汗腺再生
MSC可从骨髓、脐带、脂肪等多种组织中获得[13-14]。在合适的条件下, MSC可以分化为神经细胞、骨细胞、血管内皮细胞等多种类型的细胞[15-18], 同样具有分化为汗腺细胞的潜力。另MSC还能影响组织形成。有学者利用人脐带来源的MSC通过新型共培养技术分化为表皮样细胞, MSC促进创面修复过程中表皮样细胞的再生[19]。MSC刺激血管内皮细胞的增殖和血管的形成[20-21], 促进创面的血运重建。MSC对创面的纤维化表型有多种影响, 因此在减少创面愈合后的瘢痕形成中发挥重要作用[22]。MSC分化为血管内皮细胞, 进而产生细胞因子促进血管生成, 改善创面血供, 促进皮肤修复, 提示MSC可能有再生汗腺的潜力。
3.1. 骨髓MSC（BMMSC）
BMMSC是从骨髓基质中提取的具有分化潜能的细胞亚群。目前, BMMSC是帮助创面愈合和皮肤附属器修复的理想干细胞来源[23-24]。汗腺发育基因EDA被认为是MSC重编程成汗腺细胞的关键基因[25-26]。有学者将EDA基因转染人BMMSC后移植到烧伤小鼠创面, 通过排汗实验和免疫组织化学分析确定了损伤汗腺再生现象[27]。EDA基因通过激活核因子κB信号通路、结合EDA受体, 调节胚胎早期汗腺发育。此外, 有研究人员用慢病毒成簇规律间隔短回文重复序列及无活性相关蛋白基因9效应子和小向导RNA转染小鼠幼稚BMMSC来激活BMMSC中的EDA转录, 成功使其呈现出汗腺样表型, 证实通过无活性相关蛋白基因9效应子诱导EDA基因过表达可以促进BMMSC向汗腺样细胞转化[28]。另有研究者将人BMMSC诱导为汗腺样细胞, 并且证实HDAC4基因的甲基化参与了MSC转分化为汗腺样细胞过程的调控[29]。有学者在国内首次体外培养并扩增人BMMSC和汗腺细胞, 将汗腺细胞置于47 ℃环境中1 h建立汗腺体外热休克模型, 收集上清液作为条件培养基对BMMSC进行诱导分化, 成功诱导BMMSC转化为汗腺细胞[30]。研究人员将原代培养的人汗腺细胞进行热休克处理, 并通过Transwell板与人BMMSC共培养以诱导人BMMSC的分化, 最终人BMMSC成功向汗腺细胞分化。基于上述研究的基础, 有学者分别提取人BMMSC及其诱导分化的汗腺细胞的总RNA, 进行微小RNA（miRNA）杂交和数据分析、靶基因检测, 结果表明人BMMSC与其来源的汗腺样细胞之间有明显的miRNA差异性表达, 其中13个差异表达 > 5倍的miRNA（miRNA-132-3p、miRNA-4467、miRNA-4484、miRNA-146a-5p、miRNA-6126上调, miRNA-708-5p、miRNA-138-5p、miRNA-6812-5p、miRNA-138-1-3p、miRNA-1281、miRNA-3157-3p、miRNA-4298、miRNA-4459下调）和18个与汗腺发育通路有关的miRNA可能在BMMSC向汗腺样细胞分化过程中有重要调控作用[31]。
3.2. 人脐带MSC（hUCMSC）
hUCMSC来源于脐带基质, 具有类似于BMMSC的特性, 能够表达MSC表面抗原CD44和CD105, 不表达造血细胞系标志物CD34及汗腺细胞特异性标志物癌胚抗原。hUCMSC因其较强的多向分化和增殖能力、低免疫原性及无损伤性等特点逐渐成为干细胞再生医学研究的热点。
本研究团队将人正常汗腺细胞进行热休克处理, 收集培养基上清液配制汗腺分化诱导培养基, 从华通胶（Wharton jelly）中分离获得大量具有自我复制、自我更新、高度增殖和多向分化潜能的hUCMSC, 在汗腺分化诱导培养基中诱导其向汗腺细胞分化, 21 d后培养出具有类似正常汗腺细胞的形态特征及能够表达汗腺细胞特异性抗原的细胞；证实分化后的hUCMSC具有汗腺样细胞的形态和表型特征, 为利用hUCMSC修复汗腺损伤提供了可靠的理论依据和实验基础[32]。汗腺发育需要多种生长因子/受体, 如角质细胞生长因子（KGF）及其受体, 本研究团队在上述研究基础上向诱导培养基内加入40 ng/mL的重组人KGF, 结果表明, 含有KGF的汗腺诱导培养基可以诱导hUCMSC向汗腺细胞分化；并且将hUCMSC分化的汗腺细胞种植于严重烧伤小鼠足部, 其皮肤可以再生出具有功能的稀疏汗腺样组织[33]。
3.3. 表皮干细胞
表皮干细胞可维持正常的组织稳态, 在创面愈合过程中促进表皮再生, 并参与表皮附着物的形成[34]。表皮干细胞具有多向分化潜能, 体内研究证实其能够向皮肤附属器及表皮分化[34]。有学者通过研究小鼠表皮干细胞, 提出了隆突激活假说：当干细胞周围的微环境发生改变时, 胞外的某些信息便可以通过整合素等传递给干细胞, 以触发其跨膜信号转导, 激活干细胞的多向分化潜能[35]。
汗腺起源于胚胎期的表皮干细胞, 因此表皮干细胞被认为是汗腺再生的理想来源[36-37]。胚胎发生期, 表皮干细胞经其所处环境及细胞因子等诱导, 定向分化为汗腺细胞[38]。有研究者培养带有表皮干细胞的人KC, 并观察到高质量浓度（> 5 ng/mL）EGF能够诱导人工真皮内出现汗腺导管样结构[39]。国内有学者利用不同质量浓度（50~100 ng/mL）的EGF对人表皮干细胞进行诱导分化, 结果表明50、100 ng/mL EGF均可以显著促进人表皮干细胞增殖, 并表达汗腺细胞相对特异性的标志物钠氢交换体1及钠钾氯协同转运蛋白1[40]。有学者通过脂质体转染将miRNA-203模拟物导入人表皮干细胞, 诱导其向汗腺细胞分化, 得出结论：miRNA-203能诱导人表皮干细胞分化为人汗腺细胞, 且可能是通过靶向抑制P63实现的[41]。有研究者将人表皮干细胞接种到自制的复方壳多糖组织工程真皮基质凝胶模型, 并加入不同质量浓度（15~20 ng/mL）的EGF, 体外垂直振荡培养, 成功培养出在形态学、组织学上与在体汗腺分泌部细胞相似的管腔样结构[42]。有研究结果表明, 在小鼠爪垫匀浆和EGF的三维培养条件下, 表皮干细胞被诱导分化为汗腺样细胞。将带有此汗腺样细胞的组织工程皮肤移植到小鼠爪垫烫伤模型后, 汗腺功能得到了较好的恢复[43]。在后续研究中, Hu等[44]利用Transwell将小鼠表皮干细胞和胚胎组织共同培养, 可观察体外汗腺形态改变、组织学特征和特异性标志物。
4. 组织工程诱导汗腺再生
皮肤替代是现代医学探索已久的目标, 1869年来自日内瓦的外科医师Jacques-Louis Reverdin成功地在一例患者开放性创面中移植小块皮肤, 这件事被誉为整形外科里程碑, 使大面积开放性皮肤缺损的愈合成为可能[45]。随着研究进展, 对“创面愈合”的要求也越来越高, 不局限于创面闭合, 更要求功能重建、美学效果, 自体皮肤移植已不能完全满足当下的需求, 因此出现了生物皮肤替代物[46]。生物复合材料敷料已被证明可以改善部分创面的愈合质量, 已经成为大面积表皮烧伤或中毒性表皮坏死松解症最常用选择[47-48]。对于全层皮肤缺失的治疗通常使用现代生物皮肤替代物, 其通常以胶原蛋白支架为基础, 允许自体细胞浸润并刺激进一步的组织再生。也有使用惰性非细胞基质如异体真皮以及具有完整Fb和KC成分的细胞基质如Apligraf®[48-49]。现代生物皮肤替代物还包括将从皮肤提取出来的基因种植到支架上形成复合物[48, 50-51], 这些复合物通过灌注提供足够营养促进细胞增殖和分化, 产生一种模拟皮肤结构和生物特征的组织。研究人员将标记有溴脱氧尿嘧啶核苷的人BMMSC和人汗腺细胞在体外基质凝胶上共培养2周, 然后对BMMSC转分化形成的汗腺细胞进行形态学评估和免疫组织化学双染色, 结果表明：基质凝胶中BMMSC与汗腺细胞的三维共培养促进了BMMSC向汗腺细胞转分化, 且转分化后的BMMSC具有潜在的汗腺细胞功能[52]。为了安全有效地将BMMSC输送到创面, 有研究者将小鼠来源EGF微球与仿生支架结合, 构建了具有上皮分化和增殖潜能的工程化皮肤复合物, 将其植入小鼠背部和后脚掌的伤口, 3周后观察, 经载有EGF基因的BMMSC皮肤组织工程复合物处理的创面愈合速度加快, 上皮再生率增加, 皮肤收缩减少；组织学和免疫荧光染色分析显示, 经上述皮肤组织工程复合物处理后, 汗腺样结构变得更加明显, 植入的BMMSC数量在创面愈合后期逐渐减少。此研究就汗腺的修复和改善损伤后皮肤创伤的愈合提供了一种新的策略[53]。国外有学者构建了一种新的汗腺原位再生支架[54]。他们将胶原-壳聚糖多孔支架与DNA-EGF复合物相结合, 获得基因激活支架（GAS）, 并接种于大鼠BMMSC, 多孔支架功能化为整合的基因复合物的储存库, 这些复合物以持续的方式释放。接种的BMMSC被释放的复合物原位转染, 并在表达的EGF的诱导下在体外特异性分化为汗腺细胞, 即癌胚抗原、细胞角蛋白8、细胞角蛋白14等主要汗腺标志物水平均呈阳性表达, 证实接种于大鼠BMMSC的GAS可促进体内汗腺样结构的再生。
此外, 组织工程三维打印ECM在诱导MSC分化中展现了巨大的潜力[55]。2012年, Koch等[56]基于激光诱导正向传递原理, 采用激光辅助生物打印技术, 以小鼠皮肤组织为例, 三维打印了嵌入胶原蛋白的Fb和KC, 为实现三维体外模型和组织替代物在组织工程中的应用提供了发展方向。Michael等[57]通过激光辅助生物打印成功三维打印Fb和KC细胞结构, 并在小鼠体内生成相应的组织, 在小鼠模型实验中还观察到一些血管从创面和创面边缘向打印细胞方向生长。国内有研究者基于组织工程三维打印技术构建3种三维微结构仿生模型, 通过比较直径为210、340、420 μm的喷头的打印效果, 340 μm组的三维微结构仿生模型在促进小鼠表皮干细胞增殖、维持细胞活性及诱导小鼠表皮干细胞定向分化为汗腺细胞等方面均为最佳选择[52]。研究人员利用三维生物打印的微环境, 成功诱导小鼠乳腺祖细胞分化为汗腺细胞, 并且得出结论血红素加氧酶1可以对三维结构的激活做出反应, 并参与MSC分化[48]。胶原三螺旋重复蛋白1和血红素加氧酶1通过抑制和激活实验协同提高汗腺基因表达谱。过去有研究证实, 基质凝胶可诱导汗腺细胞重建汗腺的三维结构, 但三维重建的潜在机制尚不清楚, 最新研究成果认为胞外信号调节激酶1/2信号通路在EGF受体诱导的小汗腺样结构的三维结构中发挥重要作用[58]。目前对于组织工程-三维技术成功诱导分化出汗腺细胞的研究非常少, 该技术作为一项有潜力的新兴技术具有广阔的研究前景。
5. 总结
大面积深度烧伤患者伤至真皮深层或皮肤全层, 汗腺组织损伤无法修复, 严重影响患者排汗功能和生活质量, 如何再生足够数量汗腺、修复患者皮肤的排汗功能成为当下皮肤再生研究的重点之一。干细胞、组织工程等修复技术推动了汗腺修复再生技术的进步, 并取得阶段性的成果, 为汗腺再生研究提供了一定的参考。
Funding Statement
国家自然科学基金面上项目（81571916、81372079）
General Program of National Natural Sci⁃ ence Foundation of China (81571916, 81372079)
Footnotes
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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